针对自动聚焦过程中的聚焦评价函数、聚焦窗口、搜索算法进行了研究。首先改进了Robert函数增加了聚焦评价函数的陡峭度；其次针对固定聚焦窗口无法准确找到聚焦物体的缺点，提出了一种动态选择聚焦窗口的方法，该方法将图像分块，利用不同子块的梯度变化程度区分物体和背景，该方法更具适应性；进而提出了大步长和小步长相结合的爬山搜索算法，经过改进后的爬山搜索算法能更准确地找到焦平面；最后通过自行研发的显微视觉系统验证了所提自动聚焦方案的有效性。